Die Ribonuklease PNPase ist ein wichtiger Regulator der Biofilmbildung in Listeria monocytogenes und beeinflusst die Invasion von Wirtszellen

npj Biofilms and Microbiomes Band 9, Artikelnummer: 34 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Biofilme bieten eine Umgebung, die Mikroorganismen vor äußeren Belastungen wie Nährstoffmangel, Antibiotikabehandlungen und Immunabwehr schützt und so günstige Bedingungen für das Überleben und die Pathogenese von Bakterien schafft. Hier zeigen wir, dass das RNA-bindende Protein und die Ribonuklease-Polynukleotid-Phosphorylase (PNPase) ein positiver Regulator der Biofilmbildung beim menschlichen Krankheitserreger Listeria monocytogenes sind, einem Hauptverantwortlichen für Lebensmittelkontaminationen in Lebensmittelverarbeitungsumgebungen. Der PNPase-Mutantenstamm produziert weniger Biofilm-Biomasse und weist eine veränderte Biofilm-Morphologie auf, die anfälliger für eine Antibiotikabehandlung ist. Durch biochemische Tests und mikroskopische Analysen zeigen wir, dass PNPase ein bisher unerkannter Regulator der Zusammensetzung der extrazellulären Biofilmmatrix ist, der die Spiegel von Proteinen, extrazellulärer DNA und Zucker stark beeinflusst. Bemerkenswert ist, dass wir die Verwendung des fluoreszierenden Komplexes Rutheniumrot-Phenanthrolin für den Nachweis von Polysacchariden in Listeria-Biofilmen angepasst haben. Die transkriptomische Analyse von Wildtyp- und PNPase-Mutanten-Biofilmen zeigt, dass PNPase viele regulatorische Wege beeinflusst, die mit der Biofilmbildung verbunden sind, insbesondere durch Beeinflussung der Expression von Genen, die am Metabolismus von Kohlenhydraten (z. B. lmo0096 und lmo0783, die PTS-Komponenten kodieren) und Aminosäuren beteiligt sind (z. B. lmo1984 und lmo2006, die für biosynthetische Enzyme kodieren) und im Agr-Quorum-Sensing-ähnlichen System (lmo0048-49). Darüber hinaus zeigen wir, dass PNPase die mRNA-Spiegel des Hauptregulators der Virulenz PrfA und PrfA-regulierter Gene beeinflusst, und diese Ergebnisse könnten dazu beitragen, die verringerte bakterielle Internalisierung der ΔpnpA-Mutante in menschlichen Zellen zu erklären. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass PNPase ein wichtiger posttranskriptioneller Regulator für Virulenz und Anpassung an den Biofilm-Lebensstil grampositiver Bakterien ist und unterstreicht die wachsende Rolle von Ribonukleasen als entscheidende Akteure bei der Pathogenität.

Biofilme sind die vorherrschende Wachstumsart für Mikroorganismen in natürlichen Ökosystemen. Sie stellen jedoch zunehmend ein medizinisches Problem dar, da 80 % der mikrobiellen Infektionen mit Biofilmen einhergehen1,2 und zur Persistenz chronischer Infektionen beitragen3. Biofilme sind definiert als Gemeinschaften von Mikroorganismen, die an biotischen oder abiotischen Oberflächen haften und in selbst produzierten hydratisierten extrazellulären Polymersubstanzen (EPS) eingeschlossen sind, die auch als Biofilmmatrix4,5 bezeichnet werden. Polysaccharide, Proteine, Phospholipide und Nukleinsäuren sind die Hauptbestandteile der extrazellulären Biofilmmatrix6. Sessile Mikroorganismen werden durch die umgebende Matrix geschützt und können äußeren Belastungen wie Nährstoffmangel und Austrocknung viel besser standhalten als Planktonbakterien. Außerdem sind sie viel weniger anfällig für die Wirkung antimikrobieller Wirkstoffe und der Immunabwehr des Wirts7. Die Struktur des Biofilms ermöglicht die Ansammlung von Bestandteilen lysierter Zellen und begünstigt den horizontalen Gentransfer zwischen Bakterien und die Zell-Zell-Kommunikation6,8.

Die Bildung von Biofilmen wird mit der Virulenz mehrerer pathogener Bakterien in Verbindung gebracht, indem sie Infektionen begünstigt. Listeria monocytogenes (Listeria) ist ein grampositives pathogenes Bakterium, das Listeriose verursacht, eine der tödlichsten lebensmittelbedingten Infektionen beim Menschen9. Es kann intrazellulär überleben, die Zellmaschinerie des Wirts manipulieren und dem Immunsystem entkommen10. L. monocytogenes hält widrigen Umweltbedingungen wie niedrigen Temperaturen, niedrigem pH-Wert und hohen Salzkonzentrationen stand11. Darüber hinaus kann es auf verschiedenen Arten von Oberflächen haften, in Form von Biofilmen in Lebensmittelverarbeitungsumgebungen verbleiben und Lebensmittel kontaminieren, was dieses Bakterium zu einer großen Belastung für die Lebensmittelindustrie macht12,13,14,15. Beim Wachstum unter statischen Bedingungen können L. monocytogenes-Biofilme entweder in Form einer bakteriellen Monoschicht vorliegen16 oder einen wabenartigen Biofilm17 bilden. Unter kontinuierlichen Strömungsbedingungen können sie auch kugelförmige Strukturen bilden18.

Die Bildung von Biofilmen ist ein komplexer und multifaktorieller Prozess. Bei L. monocytogenes, wie auch bei anderen bakteriellen Krankheitserregern, wurde gezeigt, dass die Schwimmfähigkeit19 und das Agr-Quorum-Sensing-ähnliche System in den frühen Stadien der Biofilmbildung wichtig sind, wobei letzteres an der Regulierung von Proteinen beteiligt ist, die für die Adhäsion relevant sind Oberflächen und/oder Bakterien20,21. Darüber hinaus sind sowohl der Transkriptionsregulator der Virulenz PrfA als auch der Stressreaktionsregulator σB wichtig für die Biofilmentwicklung in Listerien, insbesondere durch die Steuerung der Expression von Genen wie actA, inlA und rmlA22,23,24,25. Beispielsweise wurde gezeigt, dass der PrfA-regulierte Faktor ActA an der bakteriellen Aggregation beteiligt ist, einem Schlüsselschritt bei der Biofilmbildung24. PrfA ist für die Expression mehrerer Virulenzfaktoren verantwortlich, wie etwa der Oberflächenproteine ​​Internaline, die für die Invasion von Säugetierzelllinien essentiell sind10,26. Darüber hinaus spielen andere Faktoren eine Rolle bei der Biofilmbildung in pathogenen Bakterien, wie z. B. sRNAs27,28 und c-di-GMP29,30.

Ein weiterer Faktor, der die Biofilmbildung bei anderen Bakterienarten reguliert, ist das RNA-bindende Protein Polynukleotidphosphorylase (PNPase). Es handelt sich um eine hochkonservierte 3'-5'-Exoribonuklease, die den Abbau und die Verarbeitung von RNA31 katalysiert und an virulenzbezogenen Prozessen in verschiedenen Bakterienarten beteiligt ist32,33,34. Wir hatten zuvor herausgefunden, dass PNPase ein wichtiges Enzym in L. monocytogenes für die Verarbeitung und Funktion eines CRISPR-Elements ist35. Bei den gramnegativen Bakterien Escherichia coli K-12 und Salmonella enterica Serovar Typhimurium wurde gezeigt, dass die Inaktivierung von PNPase die Biofilmbildung beeinträchtigt36,37,38. Im E. coli-C-Stamm zeigte die PNPase-Deletionsmutante jedoch eine erhöhte Biofilmbildung39. Daher muss die Rolle der PNPase bei der Biofilmbildung noch vollständig geklärt werden, während noch unbekannt ist, ob PNPase die Biofilmbildung in grampositiven Bakterien beeinflusst.

In dieser Arbeit zeigen wir, dass die Inaktivierung der PNPase in L. monocytogenes zu einer verringerten Zellinvasion und starken Defekten in der Biofilmproduktion führt, was die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix stark beeinflusst. Außerdem zeigte die RNA-Sequenzierungsanalyse, dass PNPase an der Regulierung verschiedener Wege beteiligt ist, die die Biofilmbildung beeinflussen, nämlich Quorum Sensing und Metabolismus von Kohlenhydraten und Aminosäuren. Daher präsentieren wir PNPase als neuen Biofilmregulator bei grampositiven Krankheitserregern.

PNPase ist an virulenzbezogenen Prozessen in verschiedenen Bakterienarten beteiligt, auch wenn ihre Rolle noch nicht vollständig geklärt ist und zwischen verschiedenen Bakterien unterschiedlich sein kann (Übersicht in Lit. 31). Um festzustellen, ob PNPase für die Virulenz von L. monocytogenes wichtig ist, haben wir die Fähigkeit des Wildtyps (WT), der PNPase-Deletionsmutante (ΔpnpA) und der PNPase-komplementierten Stämme (ΔpnpA::pnpA) getestet, in Wirtszellen einzudringen. Dafür verwendeten wir zwei gut etablierte menschliche Epithelzelllinien: HeLa (aus Gebärmutterhalskrebs isoliert und häufig als Studienmodell verwendet) und HepG2 (aus Hepatozyten gewonnene Zellen, da die Leber ein bevorzugtes Ziel für Listeria-Infektionen ist). Bakterienkulturen wurden verwendet, um die menschlichen Zellen eine Stunde lang zu infizieren, gefolgt von einer einstündigen Behandlung mit Gentamycin, das extrazelluläre Bakterien abtötet40. Intrazelluläre Bakterien wurden nach der Lyse der Wirtszellen gewonnen und die Lebensfähigkeit wurde auf BHI-Agarplatten bestimmt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass PNPase für den Eintritt in beide Zelllinien notwendig war, da die ΔpnpA-Mutante weniger invasiv war als der Wildtyp (Abnahme von ~95 % bei HeLa und 80 % bei HepG2) (Abb. 1). Der komplementierte Stamm zeigte eine teilweise Erholung bei der HeLa-Infektion und eine vollständige Komplementierung bei der HepG2-Infektion. Diese Ergebnisse zeigen, dass PNPase für die Infektion mit L. monocytogenes wichtig ist. Diese Tatsache steht im Einklang mit dem, was für andere pathogene Bakterien beschrieben wurde34 und unterstreicht die Rolle der PNPase bei der bakteriellen Virulenz.

Quantifizierung intrazellulärer Bakterien in HeLa- und HepG2-Zellen 2 Stunden nach der Infektion, bei MOI 50 für HeLa und MOI 40 für HepG2. Die gemittelten Replikatwerte wurden auf die Inokulumkonzentration (KBE/ml zum Zeitpunkt der Infektion) normalisiert und die transformierten Daten als Prozentsatz der überlebenden Bakterien im Verhältnis zum Wildtyp ausgedrückt. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dar. Die Signifikanz wurde durch einen ungepaarten t-Test bestimmt; *P < 0,05, **P < 0,01.

Veränderungen in der Zellgröße, -form und -motilität wurden mit Virulenzdefekten bakterieller Krankheitserreger in Verbindung gebracht, da diese Merkmale die Wirtsinvasion beeinflussen können41,42. Um festzustellen, ob der Unterschied in der Kolonisierungsfähigkeit von Wirtszellen durch Listeria monocytogenes EGD-e (Wildtyp) und die ΔpnpA-Mutantenkulturen auf eine phänotypische Variation zwischen diesen Stämmen zurückzuführen sein könnte, analysierten wir zunächst ihre mikroskopische Zellmorphologie (Abb. 2a). ). Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Zellgröße zwischen diesen beiden Stämmen oder dem komplementierten Stamm gefunden. Als nächstes analysierten wir die Morphologie der Makrokolonien aller auf BHI-Agarplatten gezüchteten Stämme; und es wurden auffällige Unterschiede beobachtet (Abb. 2b). Alle Kolonien zeichneten sich durch einen zentralen Kern mit einem konzentrischen Ring aus, der von einem Randbereich mit glatter Morphologie umgeben war. Dennoch wies die äußere Region der Wildtyp- und komplementierten Makrokolonien eine gelappte Kante auf, während die ΔpnpA-Mutante eine regelmäßigere Zone mit glattem Wachstum aufwies. Der auffälligste Unterschied wurde im inneren Bereich festgestellt, da der Wildtyp ein körniges Aussehen aufwies. Stattdessen zeigte die ΔpnpA-Mutante eine gesprenkelte Morphologie, die nicht auf den inneren Kern beschränkt war, sondern überall in der Makrokolonie beobachtet wurde und hohlen Strukturen auf der Oberfläche ähnelte (ein vergrößertes Bild repräsentativer Bereiche jeder Makrokolonie ist besser zu sehen). visualisieren Sie die verschiedenen Merkmale) (Abb. 2b). Dieser Phänotyp wurde beim komplementierten Stamm nicht beobachtet, der eher dem körnigen Erscheinungsbild des Wildtyps ähnelte. Da Flagellen und Motilität auch mit Virulenz in Zusammenhang stehen, haben wir beschlossen, zu untersuchen, ob PNPase die Schwimmfähigkeit von Listeria beeinflussen könnte. Kulturen des Wildtyps und der ΔpnpA-Mutante wurden auf BHI-Weichagarplatten aufgetragen (Abb. 2c). Die Deletion der PNPase führte zu einem Stamm mit verringerter Motilität (etwa 70 % weniger) im Vergleich zum Wildtyp. Dieser fehlerhafte Phänotyp wurde im PNPase-komplementierten Stamm vollständig wiederhergestellt.

a Repräsentative Bilder einzelner Bakterienzellen in der mittleren Exponentialphase (OD600 bei 0,7–0,8) zur Beurteilung der Zellgröße und -morphologie. Maßstabsbalken, 1 µm (links). Balkendiagramm der durchschnittlichen Zellgrößen zweier unabhängiger biologischer Replikate jedes Stamms (rechts). Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar. Die Signifikanz wurde durch einen ungepaarten t-Test bestimmt. ns, nicht signifikant; *P < 0,05. b Repräsentative Bilder der Makrokolonie-Beobachtung mit einem Zoom-Mikroskop. Jeder Stamm wurde auf eine BHI-Agarplatte geimpft und 8 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Das untere Feld entspricht einer Zoomvergrößerung. Maßstabsbalken, 1000 µm. c Repräsentative Bilder der Schwimmmotilitätsbewertung von Bakterienkulturen, die auf 0,3 % (w/v) BHI-Agar getupft und 48 Stunden lang bei 25 °C inkubiert wurden (links). Balkendiagramm der Schwimmbereiche jeder Sorte (rechts). Die gemittelten Replikatwerte wurden als prozentuale Motilität relativ zum Wildtyp transformiert. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dar. Die Signifikanz wurde durch einen ungepaarten t-Test bestimmt; **P < 0,01, ***P < 0,005.

Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass die Inaktivierung von PNPase phänotypische Veränderungen mit Unterschieden in der Koloniemorphologie und Zellmotilität verursacht, die mit der weniger invasiven Natur dieses Stamms korrelieren.

Koloniemorphologie und Motilität sind zwei miteinander verbundene Phänotypen, von denen bekannt ist, dass sie die Bildung bakterieller Biofilme beeinflussen43,44. Um festzustellen, ob die veränderten Morphotyp- und Motilitätsdefekte, die in der PNPase-Mutante von Listeria monocytogenes gefunden wurden, die Biofilmbildung beeinflussen könnten, verglichen wir als nächstes die Menge an Biofilm, die vom Wildtyp, ΔpnpA und komplementierten Stämmen produziert wurde. Bakterien wurden statisch in BHI-Medium bei 37 °C in Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet. Nach der Entfernung der Planktonzellen und dem Waschen wurden die an der Oberfläche haftenden Biofilme mit Kristallviolett (CV) gefärbt. Wir beobachteten, dass die Listeria-PNPase-Deletionsmutante im Vergleich zum Wildtyp eindeutig fehlerhafte (40 % weniger) Biofilmbildung aufwies (Abb. 3a). Dieser Phänotyp wurde im PNPase-komplementierten Stamm zumindest teilweise wiederhergestellt. Darüber hinaus unterschied sich die Morphologie des in der ΔpnpA-Mutante beobachteten Biofilms deutlich von den Biofilmen der beiden anderen Stämme (Abb. 3a, links). Die Inaktivierung von PNPase führte zu einem Biofilm mit ausgeprägten streifenförmigen Rändern, die in Zellen, die PNPase exprimierten, nicht nachgewiesen wurden. Darüber hinaus beobachteten wir, dass sich der Biofilm in der ΔpnpA-Mutante während der Waschschritte leichter ablöste, was darauf hindeutet, dass dieser Biofilm weniger haftet und weniger strukturiert ist.

a Biofilme wurden 48 Stunden lang statisch bei 37 °C gezüchtet und die Biofilmbiomasse wurde mithilfe der Kristallviolett-Färbemethode bestimmt. Links sind Biofilme nach Zugabe von Kristallviolett abgebildet. Rechts sind gemittelte Werte der Extinktion bei 595 nm aufgetragen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dar. Die Signifikanz wurde durch einen ungepaarten t-Test bestimmt; ***P < 0,005. b Repräsentative dreidimensionale Strukturen der Biofilme wurden nach der Aufnahme von Z-Stack-Bildern durch CLSM nach 48-stündigem Wachstum bei 37 °C rekonstruiert. c Die Biomasse, die maximale Dicke und der Rauheitskoeffizient der abgebildeten Biofilme wurden von COMSTAT quantifiziert. Die Wiederholungswerte wurden gemittelt und grafisch dargestellt. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dar. Die Signifikanz wurde durch einen ungepaarten t-Test bestimmt; *P < 0,05. d Repräsentative Bilder von Biofilmen, die mittels REM bei 2000-facher und 10.000-facher Vergrößerung beobachtet wurden.

Um die Architektur des Listeria-Biofilms weiter zu beurteilen, verwendeten wir konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM). Biofilme wurden 48 Stunden lang bei 37 °C auf Glasdeckgläsern auf 24-Well-Platten gezüchtet. Anschließend wurden die Biofilme vorsichtig gewaschen, um nicht anhaftende Bakterienzellen zu entfernen, und mit SYTO™ 9 angefärbt, einem zelldurchdringenden fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff, der Bakterien und extrazelluläre DNA45 (eDNA) markiert. Von jedem Biofilm wurden Z-Stapel erstellt und in dreidimensionale Projektionen rekonstruiert. Wie in Abb. 3b gezeigt, bildete der Listeria-Wildtyp-Stamm Biofilme, die einem dichten Bakterienrasen mit einigen Zellaggregaten ähnelten. Im Gegensatz dazu bildete der ΔpnpA-Mutantenstamm einen spärlichen Biofilm mit vielen leeren Bereichen zwischen einzelnen Bakterienzellen. Im PNPase-komplementierten Stamm ähnelten die Biofilme denen des Wildtyp-Stammes. Darüber hinaus wurden die strukturellen Unterschiede in der Biofilmbildung quantifiziert (Abb. 3c). Der Wildtyp-Biofilm wies mehr Biomasse auf und war deutlich dicker als der ΔpnpA-Mutanten-Biofilm. In Bezug auf die Rauheit des Biofilms wiesen Wildtyp-Biofilme einen niedrigeren Rauheitskoeffizienten auf als ΔpnpA-Mutanten-Biofilme, da der Wildtyp ein homogeneres Erscheinungsbild aufweist, während ΔpnpA-Mutanten ein geringeres Biovolumen aufweisen und mehr Hohlräume aufweisen. Biofilme aus dem PNPase-komplementierten Stamm zeigten mittlere Werte für Biomasse und Rauheit, obwohl die maximale Dicke aufgrund der Heterogenität bei der Z-Stapel-Bildaufnahme höher war als beim Wildtyp. Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse die aus CV-Assays erhaltenen Informationen und deuten zusammen auf eine Verringerung der Bildung von ΔpnpA-Mutanten-Biofilmen hin.

Um die morphologische Natur der reduzierten Listeria-Biofilmbildung bei fehlender PNPase-Expression besser zu verstehen, wurde die Biofilmarchitektur des Wildtyps, der ΔpnpA-Mutante und des PNPase-komplementierten Stamms durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM) weiter untersucht. Es konnte leicht beobachtet werden, dass Biofilme des Wildtyp-Stammes eine glatte und hydratisierte Oberfläche aufwiesen, die sich deutlich von der rauen und rissigen Oberfläche der ΔpnpA-Mutante unterschied (Abb. 3d). Eine stärkere Vergrößerung zeigte, dass Wildtyp-Bakterien größtenteils von extrazellulärem Material bedeckt waren, was es schwierig machte, die Umrisse einzelner Zellen zu erkennen. Im krassen Gegensatz dazu waren die mutierten ΔpnpA-Bakterien nicht in eine dichte extrazelluläre Matrix eingebettet und Zellen konnten leicht nachgewiesen werden. Der PNPase-komplementierte Stamm zeigte einen Biofilm-Phänotyp, der dem Wildtyp ähnlicher war, mit einer glatten Oberfläche und einem höheren Gehalt an extrazellulärer Matrix als der ΔpnpA-Mutant. Wir stellen jedoch fest, dass die Komplementierung nicht vollständig war, da auch einige Flecken rauer Biofilmoberfläche und Bakterien, die nicht in der extrazellulären Matrix eingeschlossen waren, entdeckt wurden. Die teilweise Komplementierung verschiedener Phänotypen, die im ΔpnpA::pnpA-Stamm erhalten wurden, hängt wahrscheinlich mit unterschiedlichen Niveaus der PNPase-Expression in den verschiedenen hier getesteten Testbedingungen zusammen. Dies könnte eine Folge der Klonierungsstrategie sein, die für die Amplifikation des pnpA-Gens für die Klonierung im pPL2-Plasmid verwendet wird und bei der möglicherweise Aktivatorregionen oder andere Promotoren in der Upstream-Sequenz von pnpA fehlen (siehe „Methoden“).

Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass PNPase L. monocytogenes-Biofilme beeinflusst, indem sie die Bildung der extrazellulären Matrix stört. Die Inaktivierung der Listeria-PNPase führt zu reduzierten und dünneren Biofilmen mit einem deutlich geringeren Anteil ihrer extrazellulären Matrix.

Die Matrix der Biofilme von Listeria monocytogenes besteht aus EPS, nämlich eDNA, Proteinen und Polysacchariden46. Im Anschluss an die vorherigen Ergebnisse untersuchten wir die makromolekulare Biofilmmatrixzusammensetzung des Wildtyps ΔpnpA und der komplementierten Stämme, um zu verstehen, ob die beobachteten Unterschiede in der Biofilmstruktur und -morphologie auf Änderungen in der Matrixzusammensetzung zurückzuführen sind. Biofilme, die 48 Stunden lang bei 37 °C gewachsen waren, wurden von der abiotischen Oberfläche abgeschabt und einer Ultraschallbehandlung unterzogen, um die EPS von den Bakterienzellen zu trennen. Nach der Ultraschallbehandlung wurde die OD600 zur weiteren Normalisierung jeder Matrixkomponente im Vergleich zur gesamten Biofilmbiomasse jedes Stamms gemessen. Das im Überstand gewonnene EPS wurde mithilfe unterschiedlicher biochemischer Techniken entsprechend der Komponente in der Studie weiter quantifiziert: Phenol-Chloroform-Extraktionsmethode für eDNA, Bradford-Methode für Proteine ​​und Phenol-Schwefelsäure-Methode für Polysaccharide. Bemerkenswerterweise deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Menge der drei Hauptkomponenten der extrazellulären Listeria-Matrix im ΔpnpA-Mutantenstamm im Vergleich zum Wildtyp verringert war (Abb. 4a). Außerdem beobachteten wir, dass der komplementierte Stamm den Wildtyp-Phänotyp teilweise wiederherstellen konnte.

a Relative Quantifizierung des extrazellulären DNA-, Protein- und Polysaccharidgehalts in der Matrix von Biofilmen, die während 48 Stunden bei 37 °C gewachsen sind. Die gemittelten Replikatwerte wurden als Prozentsatz relativ zum Wildtyp transformiert. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dar. Die Signifikanz wurde durch einen ungepaarten t-Test bestimmt; *P < 0,05, **P < 0,01. b Repräsentative Bilder der CLSM-Analyse der Zusammensetzung der Biofilmmatrix. SYTO™ 9 wurde als Kontrolle zum Färben von Bakterien verwendet, TO-PRO™-3-Iodid wurde für die extrazelluläre DNA-Färbung, SYPRO® Ruby für die Proteinfärbung und RR-OP für die Polysaccharidfärbung verwendet.

Um diese Ergebnisse weiter zu validieren und die verschiedenen Matrixkomponenten zu visualisieren, wurden 48 Stunden lang gewachsene Biofilme anschließend mit CLSM analysiert, nachdem sie mit spezifischen Farbstoffen für jede Komponente angefärbt wurden, wie in repräsentativen Bildern in Abb. 4b dargestellt. Der Iodid-Fluoreszenzfarbstoff TO-PRO™-3 zielt auf Nukleinsäuren ab, jedoch nicht auf Bakterien mit intakten Membranen. Daher wurde es für den eDNA-Nachweis auf der extrazellulären Matrix verwendet, da es bei gleichzeitiger Verwendung mit dem Farbstoff SYTO™ 9 die Unterscheidung zwischen eDNA und DNA in Biofilmzellen ermöglicht45. In Abb. 4b wurde eine starke Verringerung der eDNA-Spiegel im mutierten ΔpnpA-Biofilm festgestellt, wobei nur wenige Zellen gefärbt waren, während im Wildtyp-Biofilm ein sternförmiges eDNA-Muster beobachtet wurde. Der Farbstoff FilmTracer™ SYPRO® Ruby Biofilm Matrix wird zur Proteindetektion47 verwendet und konnte an proteinreiche Aggregate in der Matrix des Wildtyp-Biofilms binden, färbte jedoch nur einzelne Zellen im ΔpnpA-Mutanten-Biofilm (Abb. 4b). Dies zeigt, dass der Proteingehalt in der extrazellulären Matrix des PNPase-defizienten Stamms geringer ist. Das Färben der in der Biofilmmatrix von Listerien vorhandenen Polysaccharide war ein anspruchsvolleres Verfahren. Zuerst testeten wir den Fluoreszenzfarbstoff Weizenkeimagglutinin (WGA), konjugiert mit Alexa Fluor 633, der häufig zum Nachweis von Polysacchariden in grampositiven Biofilmen verwendet wird, insbesondere in Staphylococcus aureus48. Allerdings war dieser Farbstoff bei der Markierung von Polysacchariden in Listeria-Biofilmen nicht wirksam, zumindest unter den hier getesteten Bedingungen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, testeten wir als nächstes Rutheniumrot (RR), einen Farbstoff, der sich an Kohlenhydrate bindet und bekanntermaßen Listeria-Biofilme färbt49. RR ist nicht fluoreszierend, aber wenn es mit nicht fluoreszierendem 1,10-Phenanthrolin (OP) konjugiert wird, entsteht der fluoreszierende RR-OP-Komplex, der zuvor zur Markierung anionischer Substrate wie Chromatin aus Erythrozytenkernen verwendet wurde50. Wir haben RR-OP synthetisiert und seine Fähigkeit getestet, die in Listeria EPS vorhandenen Polysaccharide zu markieren. Wie in Abb. 4b beobachtet, bindet RR-OP erfolgreich an die in der Biofilmmatrix vorhandenen Polysaccharide. Die Färbung war in der Wildtyp-Matrix intensiver, färbte die ΔpnpA-Mutante jedoch schlecht, was zeigt, dass in der mutierten Biofilmmatrix geringere Mengen an Polysacchariden vorhanden sind. Nach unserem besten Wissen war dies das erste Mal, dass RR-OP als Fluoreszenzfärbemethode für Polysaccharide auf Listeria-Biofilmen verwendet wurde, was ein neues Werkzeug darstellte, das für die Untersuchung bakterieller Biofilme nützlich sein könnte. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Inaktivierung von PNPase zu einer Verringerung des EPS in Listeria-Biofilmen führt, was sich auf den Gehalt an eDNA, Proteinen und Polysacchariden auswirkt.

Biofilme sind aufgrund ihrer robusten Struktur und der Schutzfunktion der umgebenden Matrix resistenter gegen die Wirkung antimikrobieller Wirkstoffe. Da die Inaktivierung von PNPase zu dünneren Biofilmen mit geringerem EPS-Gehalt führt, haben wir als Nächstes untersucht, ob Biofilme mit PNPase-Mangel weniger resistent gegen eine Antibiotikabehandlung sind. Die beiden zur Behandlung von Listeriose verwendeten Antibiotika wurden ausgewählt, in diesem Fall Gentamicin und Erythromycin (die als Erst- bzw. Zweitlinien-Therapeutika gelten51,52). Zunächst wurden die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) der in BHI-Brühe gezüchteten Planktonkulturen bestimmt und zeigten keine Unterschiede zwischen den Stämmen hinsichtlich der Bakterienkultivierbarkeit in BHI-A-Platten (3 µg/ml für Gentamicin und 0,1 µg/ml für Erythromycin). ). Anschließend wurden 48 Stunden lang statisch in BHI gezüchtete Wildtyp- und ΔpnpA-Mutanten-Biofilme einer Behandlung mit hohen Dosen jedes Antibiotikums unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Biofilme gewaschen, einem Ultraschallbad ausgesetzt und abgekratzt, um die anhaftenden Zellen von der abiotischen Oberfläche zu lösen. Die gewonnenen Biofilmzellen wurden zur KBE/ml-Bewertung auf BHI-Agarplatten ausplattiert. Parallel dazu wurde BHI ohne Antibiotikum als Kontrolle für die Zellkultivierungsfähigkeit verwendet. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp und ΔpnpA-Mutante, wenn den vorgeformten Biofilmen kein Antibiotikum zugesetzt wurde, was zeigt, dass die Inaktivierung von PNPase die Zellkultivierungsfähigkeit in Listeria-Biofilmen nicht beeinträchtigt (Abb. 5). Im Gegensatz dazu führte jede Antibiotikabehandlung zu einer geringeren Kultivierungsfähigkeit der ΔpnpA-Mutante im Vergleich zum Wildtyp, obwohl wir feststellten, dass diese Verringerung weniger als 1 Log betrug. Dieser Effekt war bei der Behandlung mit Gentamicin stärker ausgeprägt (der ΔpnpA-Stamm war 75 % weniger kultivierbar), obwohl auch bei Verwendung von Erythromycin eine Verringerung der Kultivierungsfähigkeit beobachtet wurde (ΔpnpA-Stamm war 40 % weniger kultivierbar) (Abb. 5). Der komplementierte Stamm zeigte bei beiden Antibiotikabehandlungen eine nahezu vollständige Komplementierung. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Biofilm der PNPase-Mutante anfälliger für Antibiotika ist als der Wildtyp. Dies stimmt voll und ganz mit unseren früheren Beobachtungen überein, dass PNPase-defiziente Biofilme weniger strukturiert sind und weniger extrazelluläre Matrixkomponenten aufweisen.

Biofilme, die 48 Stunden lang bei 37 °C gezüchtet wurden, wurden einer 24-stündigen Behandlung mit hohen Dosen Gentamicin (10X MHK) oder Erythromycin (100X MHK) unterzogen. Zur Kontrolle der Bakterienkultivierung wurde BHI anstelle eines Antibiotikums zugesetzt. Nach jeder Behandlung wurden die gewonnenen kultivierbaren Zellen als KBE/ml quantifiziert. Die Replikatwerte wurden gemittelt und als Prozentsatz von KBE/ml relativ zum Wildtyp transformiert. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dar. Die Signifikanz wurde durch eine Zwei-Wege-ANOVA bestimmt; ns, nicht signifikant; ****P < 0,0001.

Um besser zu verstehen, wie PNPase die Genexpression bei der Biofilmbildung beeinflusst, verglichen wir das Transkriptom zwischen ΔpnpA-Mutanten- und Wildtyp-Biofilmkulturen. Die Gesamt-RNA wurde aus Biofilmkulturen extrahiert, die 48 Stunden lang bei 37 °C gezüchtet wurden, und einer RNA-Sequenzierung (RNA-seq) unterzogen. Anhand der RNA-seq-Daten haben wir die unterschiedliche Transkriptexpression zwischen ΔpnpA-Mutanten und Wildtyp-Biofilmen bewertet, indem wir die Faltungsänderung für jedes Transkript in einem MA-Streudiagramm berechnet und aufgezeichnet haben (Abb. 6a). Um die statistisch signifikanten differentiell exprimierten Gene (DEGs) zu bestimmen, haben wir die folgenden Parameter definiert: eine False-Discovery-Rate (FDR) von weniger als 0,1, eine Fold Change von mehr als 2 und einen höheren Expressionswert der Transkripte (log2 CPM). als 3. Obwohl die Streuung der log2-fachen Änderungswerte für die meisten Transkripte erheblich verringert war, wurden insgesamt 103 Gene unterschiedlich exprimiert (Ergänzungstabelle 1), von denen 46 herunterreguliert und 57 hochreguliert waren (Abb. 6a). . Bemerkenswerterweise beobachteten wir bei der Gruppierung der DEGs nach ihrer allgemeinen biologischen Rolle, dass die Mehrheit der DEGs entweder Teil des „Kohlenhydrattransports und -stoffwechsels“ (n = 14) oder des „Aminosäuretransports und -stoffwechsels“ (n = 11) war ) Gruppen, zusammen mit den nicht kategorisierten DEGs (n = 37) (Abb. 6b). Als nächstes wurden DEGs der KEGG-Datenbank zugeordnet, um jedes Gen seinem jeweiligen Signalweg zuzuordnen, gefolgt von einer KEGG-Signalweganreicherungsanalyse (Abb. 6c). Die Ergebnisse zeigten eine Anreicherung der Stoffwechselwege, die an „Stoffwechselwegen“ (n = 36), „Biosynthese von Sekundärmetaboliten“ (n = 22) und „Mikrobieller Stoffwechsel in verschiedenen Umgebungen“ (n = 14) beteiligt sind. Wir können eine gute Korrelation zwischen den in Abb. 6b ermittelten Kategorien und den in Abb. 6c beschriebenen angereicherten KEGG-Pfaden beobachten: Die Kategorie „Aminosäuretransport und -stoffwechsel“ wird durch die Anreicherung von „Biosynthese von Aminosäuren“, „Alanin, Aspartat“ unterstützt und Glutamatstoffwechsel“ und „Valin-, Leucin- und Isoleucin-Biosynthese“-Wege; Auf die gleiche Weise kann die Kategorie „Kohlenhydrattransport und -stoffwechsel“ die KEGG-Pfade „Kohlenstoffstoffwechsel“, „Citratzyklus“ und „Glykolyse/Glukoneogenese“ umfassen.

ein MA-Streudiagramm, das die Expression von Transkripten zwischen zwei biologischen Replikaten von L. monocytogenes EGD-e-Wildtyp- und ΔpnpA-mutierten Biofilmen vergleicht. Gene mit deutlich unterschiedlicher Expression werden in ΔpnpA-Biofilmen im Vergleich zum Wildtyp rot hervorgehoben, wenn sie hochreguliert sind, oder grün, wenn sie herunterreguliert sind. Der FDR-Grenzwert liegt bei <0,10. Die beiden horizontalen Linien entsprechen dem Grenzwert einer log2-fachen Änderung von 1 und die vertikale Linie dem Grenzwert des log2-CPM von 3. NS nicht signifikant. b Globale Visualisierung von differentiell exprimierten Genen (DEGs), unterteilt in allgemeine biologische Kategorien. Die Anzahl der Gene, die zu jeder Kategorie gehören, ist weiß. c DEGs mit deutlich erhöhter Anreicherung, gruppiert in vorhergesagte KEGG-Pfade. d Heatmap des Transkriptionsprofils der DEGs. Hierarchisches Clustering wurde durchgeführt, um Gene mit ähnlichem Expressionsmuster im Hinblick auf log2 RPKM zu gruppieren. e Lesen Sie Abdeckungsdiagramme von drei hochregulierten (lmo0096, lmo0783, lmo0784) und drei herunterregulierten Genen (lmo1984, lmo1986, lmo2006). lmo0783-0784 werden im Operon angezeigt. Die blaue Linie entspricht dem Wildtyp, während die rote Linie der ΔpnpA-Mutante entspricht. Die Y-Achse stellt die Abdeckung der Lesevorgänge dar und der Maximalwert jedes Gens wird angezeigt. Die x-Achse stellt die Genposition dar.

Es wurde eine Heatmap erstellt, die die normalisierten Expressionswerte der DEGs im Wildtyp und in den ΔpnpA-Mutantenstämmen zeigt (Abb. 6d). Anschließend wählten wir sechs dieser unterschiedlich exprimierten Transkripte (drei hoch- und drei herunterregulierte Gene) als Beispiele für unsere RNA-Seq-Daten aus und zeichneten ihre Leseabdeckung auf, um die Sequenzierungstiefe in beiden Stämmen zu beurteilen (Abb. 6e). Als nächstes wurden Gene als repräsentative Gene ausgewählt, die einen höheren und niedrigeren log2 FC aufwiesen und die laut Literatur zuvor mit der Bildung von Biofilmen in Verbindung gebracht wurden (Tabelle 1). Beispielsweise führte die Inaktivierung von PNPase zur Hochregulierung von Genen des Quorum-Sensing-Systems Agr (lmo0048, lmo0049), Genen der Mannose/Glucose- (lmo0096, lmo0783, lmo0784) und Maltose- (lmo2124, lmo2125) Transportsysteme sowie von Genen am Pentosephosphatweg beteiligt (lmo0342, lmo0343, lmo0345). Die Kategorien, die durch die PNPase-Inaktivierung stark herunterreguliert wurden, waren „Transport und Metabolismus von Aminosäuren“ (lmo1733, lmo1835, lmo1984, lm01986, lmo2006) zusammen mit „Energieproduktion und -umwandlung“ (lmo1052-1055). Die RNA-seq-Ergebnisse wurden durch qPCR-Analyse unter Verwendung einer Teilmenge dieser repräsentativen Gene validiert (Tabelle 1). Wir beobachteten eine gute Korrelation zwischen den beiden Techniken, was darauf hindeutet, dass die qPCR-Ergebnisse mit den RNA-seq-Daten übereinstimmten.

Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass es im ΔpnpA-Mutantenbiofilm im Vergleich zum Wildtyp eine veränderte Expression biologischer Kategorien gab, die für die Biofilmbildung wichtig sind, und dass die Mehrheit der DEGs unter der Kontrolle von PNPase entweder in Kohlenhydrat- oder Aminosäure-bezogene Prozesse integriert ist . Diese Daten bestätigen unsere vorherigen Ergebnisse, die zeigen, dass PNPase die Mengen an Polysacchariden und Proteinen aus der extrazellulären Matrix von Listeria monocytogenes-Biofilmen beeinflusst.

Um die Rolle der PNPase bei der Regulierung der wichtigsten DEGs weiter zu untersuchen, führten wir Rifampicin-mRNA-Stabilitätstests durch und verglichen die ΔpnpA-Mutante mit Wildtyp-Kulturen. Aufgrund technischer Schwierigkeiten bei der Durchführung dieser Technik in Biofilmen haben wir alternativ Kulturen in der stationären Phase verwendet, die in BHI-Medium bei 37 °C gezüchtet wurden, da Bakterien in diesem Wachstumsstadium physiologisch eher den in Biofilmen vorhandenen sessilen Bakterien ähneln53. Die Konzentrationen der mRNAs der interessierenden Gene wurden durch Northern Blot unter Verwendung spezifischer Sonden bewertet.

Wir beobachteten, dass die Inaktivierung von PNPase zu einer starken Stabilisierung von mRNAs aus hochregulierten DEGs führte (Tabelle 1), nämlich: dem Quorum-Sensing-ähnlichen System lmo0048/agrB, der PTS-Transporter-Untereinheit lmo0096/manL und dem Zucker-ABC-Transporter lmo2125/malE ( Abb. 7a). Diese Stabilisierung wurde besonders deutlich bei der Analyse der lmo0048- und lmo0096-mRNAs, die im Wildtyp kaum nachweisbare Mengen aufwiesen, was keine zuverlässige Quantifizierung der mRNA-Halbwertszeiten in diesem Stamm ermöglichte. Wir stellten fest, dass mit der lmo0048-Sonde zwei Banden unterschiedlicher Größe beobachtet wurden: eine längere Bande, die der monocistronischen mRNA entspricht (sowohl im WT als auch im ΔpnpA-Mutanten nachgewiesen), und eine kürzere Bande, die einem Zerfallszwischenprodukt entspricht (nur im ΔpnpA-Mutanten nachgewiesen). ). Die Konzentrationen beider mRNA-Spezies sind in der ΔpnpA-Mutante höher als im Wildtyp-Stamm, was insbesondere an der starken Akkumulation des kürzeren Transkripts in Abwesenheit von PNPase deutlich wird. Es ist möglich, dass die kürzere mRNA zur Produktion eines Lmo0048/AgrB-verkürzten Proteins führt, das immer noch teilweise funktionsfähig ist und möglicherweise biofilmbezogene Signalwege beeinflusst. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass PNPase als posttranskriptioneller Regulator fungiert, indem sie als Hauptenzym am Abbau von mRNAs hochregulierter Gene, die in unserer RNA-seq-Analyse identifiziert wurden, beteiligt ist. Im Gegensatz dazu wurde beobachtet, dass die mRNA eines ausgewählten herunterregulierten Gens (lmo2006) in der ΔpnpA-Mutante etwas schneller zerfällt, was wahrscheinlich zu den beobachteten verringerten Mengen dieses Transkripts in diesem Stamm beiträgt.

a Northern-Blots, die mit spezifischen Oligos zum Nachweis von lmo0048, lmo0096, lmo2125 und lmo2006 untersucht wurden, wobei RNA verglichen wurde, die aus Rifampicin-behandelten Kulturen des Wildtyps und des ΔpnpA-Mutantenstamms extrahiert wurde. Die RNA-Stabilität wird in Minuten unter dem jeweiligen Transkript angezeigt. tmRNA dient als Ladekontrolle. Für jede Sonde wird ein repräsentatives Gel aus zwei unabhängigen Replikaten angezeigt. Auf der linken Seite des Panels wird eine RNA-Größenmarkierung angezeigt. Mit der lmo0048-Sonde wurden zwei Banden nachgewiesen; Die unten im entsprechenden Bild gezeigte Halbwertszeit-Quantifizierung bezieht sich auf die kürzere Bande. Die Quantifizierung der oberen Bande ergab eine Stabilität von 6,2 ± 0,6 im Wildtyp und 7,0 ± 0,58 im ΔpnpA-Mutanten. NQ nicht quantifizierbar. b β-Galactosidase-Aktivität der Plmo0048-lacZ-Fusion und Plmo2006-lacZ-Fusion im Wildtyp- und ΔpnpA-Mutantenstamm, der bis zur stationären Phase in BHI gezüchtet wurde. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten dar. Die Signifikanz wurde durch eine Zwei-Wege-ANOVA bestimmt; ns, nicht signifikant; *P < 0,05. c Northern-Blots, die mit spezifischen Oligos zum Nachweis von prfA, hly, inlA und mogR untersucht wurden, und RNA vergleichen, die aus Rifampicin-behandelten Kulturen des Wildtyps und des ΔpnpA-Mutantenstamms extrahiert wurde. Die RNA-Stabilität wird in Minuten unter dem entsprechenden Bild angezeigt. tmRNA dient als Ladekontrolle. Für jede Sonde wird ein repräsentatives Gel aus zwei unabhängigen Replikaten angezeigt. Auf der linken Seite des Panels wird eine RNA-Größenmarkierung angezeigt. d Western-Blot-Analyse des Gesamtproteinextrakts unter Verwendung von Anti-InlA-Antikörpern. Als Ladungskontrolle wurde der Anti-EF-Tu-Antikörper verwendet. Relative RQ-Quantifizierung.

Darüber hinaus haben wir Transkriptionsfusionen konstruiert und analysiert, um zu testen, ob PNPase die Transkription von lmo0048/agrB (ein hochreguliertes Gen) und/oder lmo2006/alsS (ein herunterreguliertes Gen) beeinflussen könnte (Abb. 7b). Die Promotoraktivität dieser Gene wurde unter Verwendung des pTCV-Plasmids und lacZ als Reportergen54 analysiert. β-Galactosidase-Assays zeigten, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp und ΔpnpA-Mutante gab, was darauf hindeutet, dass PNPase die Transkription dieser Gene nicht signifikant beeinflusst. Wenn man bedenkt, dass wir keine signifikanten Veränderungen in der Transkription von lmo0048 beobachten (Abb. 7b), bestätigt dies, dass die höheren Konzentrationen der beiden RNAs in Abb. 7a auf ihre Stabilisierung in Abwesenheit von PNPase zurückzuführen sind; Daher ist PNPase für ihren Abbau verantwortlich. Das kürzere Transkript von lmo0048 war keine Folge einer erhöhten Transkription; Stattdessen resultiert diese mRNA höchstwahrscheinlich aus der Spaltung des längeren Transkripts von lmo0048 durch andere Ribonukleasen und wird durch PNPase schnell entfernt, was erklärt, warum diese mRNA im Wildtyp nicht nachgewiesen wurde (Abb. 7a).

Da wir beobachteten, dass die Inaktivierung von PNPase zu einer verringerten Invasion menschlicher Zelllinien (Abb. 1) und bakterieller Motilität (Abb. 2) führt, haben wir unsere Studien weiter auf Gene ausgeweitet, die für diese Phänotypen wichtig sind, auch wenn sie scheinbar nicht unterschiedlich sind ausgedrückt in unseren transkriptomischen Biofilmdaten. Unter Verwendung von Rifampicin-mRNA-Stabilitätstests und Northern-Blot-Analyse wurde festgestellt, dass die Inaktivierung von PNPase zu niedrigeren mRNA-Spiegeln des Transkriptionsaktivators von Virulenzgenen, prfA, zusammen mit zwei prfA-regulierten Genen, nämlich inlA (kodiert für Internalin A) und hly, führt (kodiert für Listeriolysin O) in stationären Phasenkulturen (Abb. 7c). Diese Regulierung scheint indirekt verursacht zu werden, da die Stabilität dieser Transkripte durch das Fehlen von PNPase nicht stark beeinträchtigt wurde. Wir beobachteten auch verringerte Proteinspiegel von Internalin A in Zellextrakten der ΔpnpA-Mutante, was zeigt, dass die verringerten Spiegel von inlA-mRNA mit niedrigeren Proteinspiegeln korrelieren (Abb. 7d). Andererseits beobachteten wir, dass PNPase die Spiegel und Stabilität von mogR-mRNA, dem Transkriptionsrepressor von Motilitätsgenen, nicht beeinflusst (Abb. 7c).

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass PNPase die Expressionsniveaus von Genen reguliert, die an Biofilm und Virulenz beteiligt sind, und belegen, dass PNPase ein wichtiges Enzym ist, das an der posttranskriptionellen Regulierung der Biofilmbildung beteiligt ist.

In dieser Arbeit stellen wir die Ribonuklease PNPase als neuartigen Regulator der Biofilmbildung und Virulenz im grampositiven Erreger Listeria monocytogenes vor. Wir zeigen, dass PNPase eine positive Determinante der Biofilmproduktion im Stamm L. monocytogenes EGD-e ist und die Biomasse, Morphologie und Struktur des Biofilms beeinflusst. Der PNPase-Deletionsstamm produzierte weniger Biofilm-Biomasse und zeigte eine dünnere, rauere und trocken aussehende Oberfläche sowie einen weniger strukturierten Biofilm als der Wildtyp. Dies hing mit schwerwiegenden Defekten in der Zusammensetzung der extrazellulären Biofilmmatrix der ΔpnpA-Mutante zusammen, die einen geringen Gehalt an Proteinen, Polysacchariden und extrazellulärer DNA aufwies, wie durch biochemische Tests und Mikroskopie nachgewiesen wurde. Tatsächlich wurde festgestellt, dass die in den ΔpnpA-Biofilmen vorhandenen Bakterien nicht nennenswert in eine Matrixschicht eingebettet sind, ganz im Gegensatz zu dem, was in den Wildtyp-Biofilmen beobachtet wird, wo Bakterien von einer dicken Matrix umgeben sind. Diese strukturellen Defekte führen zu einer schwachen Biofilmproduktion in der ΔpnpA-Mutante, was höchstwahrscheinlich zu einer erhöhten Anfälligkeit von Listeria-Biofilmen gegenüber Antibiotika führt. Darüber hinaus führte die Inaktivierung der Listeria-PNPase zu phänotypischen Veränderungen in Makrokolonien und einer verringerten Zellmotilität, zwei Merkmale, die häufig mit der Bildung von Biofilmen in Verbindung gebracht werden.

PNPase wurde zuvor mit der Biofilmbildung bei gramnegativen Bakterien in Verbindung gebracht; Seine genaue Rolle ist jedoch umstritten. Während gezeigt wurde, dass PNPase ein positiver Regulator der Biofilmbildung in E. coli K-1238 und in Salmonella Typhimurium ist36,37, schlug eine andere Studie mit E. coli C vor, dass PNPase ein Inhibitor der Biofilmbildung ist39. Die Wirkung der PNPase auf die Biofilmproduktion scheint daher zumindest bei gramnegativen Bakterien artabhängig zu sein. Dennoch mangelt es derzeit an Informationen über die Rolle der PNPase bei der Bildung von Biofilmen in grampositiven Bakterien und unsere Arbeit zielt darauf ab, diese Lücke zu schließen. Um besser zu verstehen, wie PNPase zur Biofilmbildung von L. monocytogenes beiträgt, wurde die transkriptomische Analyse der Wildtyp- und ΔpnpA-mutierten Biofilme durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass PNPase die Expressionsniveaus mehrerer Gene und mehrerer Regulierungswege beeinflusst, wie es von einem wichtigen posttranskriptionellen Regulator erwartet wurde. Durch RNA-Seq. wurden insgesamt 103 von PNPase betroffene DEGs erhalten, wobei 57 bzw. 46 Gene eine Hoch- bzw. Herunterregulierung zeigten. Die Mehrzahl der DEGs war entweder Teil der Gruppe „Kohlenhydrattransport und Stoffwechsel“ oder der Gruppe „Aminosäuretransport und Stoffwechsel“.

Gene, die am Quorum Sensing beteiligt sind, und Gene, die am Kohlenhydrattransport und -stoffwechsel beteiligt sind, gehören zu den am stärksten hochregulierten Genen in Listeria-Biofilmen, die keine PNPase exprimieren (Abb. 6 und Tabelle 1). Das ursprünglich in S. aureus beschriebene Agr-Quorum-Sensing-ähnliche System in L. monocytogenes ist im lmo0048-lmo0051-Operon55 kodiert. Unsere Ergebnisse zeigten die Hochregulierung der Gene lmo0048 (kodierend für ein Homolog der Sensor-Histidinkinase AgrB von S. aureus) und lmo0049 (kodierend ein Homolog des autoinduzierenden Peptids AgrD von S. aureus) in Biofilmen der ΔpnpA-Mutante (Abb. 6 und Tabelle 1). ). Es wurde zuvor gezeigt, dass das Agr-Operon für die Bildung von Listeria-Biofilmen wichtig ist, da Agr-Mutanten, nämlich Δlmo0049 (ΔagrD), bei der Adhäsion und in den ersten 24 Stunden der Biofilmbildung betroffen waren20,21,56. Die Expression des L. monocytogenes-Agr-Operons unterliegt einer zeitlichen Regulierung, wobei in den frühen Stadien des Biofilmwachstums zunehmende Expressionsniveaus zu verzeichnen sind und mit der Reifung des Biofilms anschließend abnehmen13. Wir beobachten, dass diese zeitliche Regulierung des Agrarsystems in Abwesenheit von PNPase fehlerhaft ist; Die hohen Mengen an agrB- und agrD-Transkripten, die in Biofilmen nach 48-stündigem Wachstum beobachtet wurden, könnten helfen, die Verringerung der Biofilm-Biomasse zu erklären, die in der ΔpnpA-Mutante festgestellt wurde.

Darüber hinaus wurde festgestellt, dass mehrere Gene, die am Zuckertransport und an der Bioenergetik beteiligt sind, in den ΔpnpA-Mutanten-Biofilmen hochreguliert sind. Dazu gehören Gene des Phosphoenolpyruvat (PEP)-abhängigen Zucker:Phosphotransferase-Systems (PTS) für die hochaffine Aufnahme von Mannose und Glucose. Das PTS umfasst zwei allgemeine Phosphotransferase-Proteine ​​(EI und HPr) und eine variable Anzahl zuckerspezifischer Enzym-II-Komplexe; EI und HPr übertragen Phosphorylgruppen von PEP auf EIIAB, das für die Phosphorylierung verschiedener Zucker verantwortlich ist, wobei EIICD als Transporter fungiert57,58. Unsere Ergebnisse deuten auf die Hochregulierung von lmo0096 (EIIABMan/Glu) aus dem Man-Operon und lmo0783 (EIIAMan/Glu) und lmo0784 (EIIBMan/Glu) aus dem Mpo-Operon hin. Die Hochregulierung dieser PTS kann zu einem Anstieg des Verbrauchs von glykolytischem PEP führen und somit dessen Verfügbarkeit für die Biosynthese aromatischer Aminosäuren und Zellwandvorläufer verringern59. Dies trägt höchstwahrscheinlich zu der geringeren Biofilmmatrixproduktion bei, die in den Listeria ΔpnpA-Biofilmen beobachtet wird. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese werden PTS-Enzyme während der Biofilmbildung in anderen grampositiven Bakterien herunterreguliert, wie bei Streptococcus pneumoniae60 und bei starken und schwachen Biofilmbildnern von Enterococcus faecalis61 beobachtet. Zu den weiteren hochregulierten Genen gehören lmo2124 und lmo2125, die für den ATP-bindenden Kassettentransporter kodieren, der für die Aufnahme von Maltose/Maltodextrin verantwortlich ist, das später in der Glykolyse in Form von Glucose verwendet wird62. Wir beobachteten auch die Hochregulierung von sieben Genen aus dem Gol-Operon (lmo0341-0351), die für Enzyme kodieren, die an der nichtoxidativen Phase des Pentosephosphatwegs beteiligt sind (lmo0342, lmo0343 und lmo0345), im Glycerinstoffwechsel (lmo0344, lmo0347). und lmo0348) und in der Glykolyse (lmo0346)63,64. Insgesamt deutet die höhere Expression dieser Gene darauf hin, dass der Kohlenhydratstoffwechsel bevorzugt auf die Energieproduktion und nicht auf Biosynthesewege ausgerichtet ist. Dies könnte weiter zur Erklärung der geringen Biosynthese von Matrixkomponenten und der daraus resultierenden fehlerhaften Biofilmbildung beitragen, die in Abwesenheit von PNPase beobachtet wird.

Unter den herunterregulierten Genen, die in PNPase-defekten Biofilmen gefunden wurden, konnten ebenfalls Stoffwechselwege identifiziert werden, die die Biofilmbildung beeinflussen (Abb. 6 und Tabelle 1). Eine Hauptkategorie war der Aminosäurestoffwechsel und umfasste die Gene lmo1984 (ilvB), lmo1986 (ilvC) und lmo2006 (alsS), die an der Synthese verzweigtkettiger Aminosäuren wie Isoleucin, Leucin und Valin beteiligt sind. Es wurde gezeigt, dass diese Aminosäuren die Bildung robuster Biofilme in verschiedenen Bakterien fördern: Beispielsweise wurden in E. coli-Biofilmen hohe Mengen an Leucin und Valin gefunden65,66; sie gehören zu den biofilmfördernden Aminosäuren, die in Pseudomonas aeruginosa67 identifiziert wurden; und der Metabolismus von Isoleucin, Leucin und Valin ist während der Bildung des Bifidobacterium bifidum-Biofilms von wesentlicher Bedeutung68. Ein weiteres herunterreguliertes Gen, das am Aminosäurestoffwechsel beteiligt ist, ist lmo1733 (gltD), das die kleinere Untereinheit der Glutamat-Synthase kodiert und für die Umwandlung von Glutamin in Glutamat verantwortlich ist. Es wurde auch festgestellt, dass diese Aminosäure die Biofilmbildung beeinflusst, wobei Defekte in diesem Stoffwechselweg zu einer verringerten Adhäsion an festen Oberflächen und folglich zu einer geringeren Biofilmbildung bei L. monocytogenes69 und Bacillus subtilis70 führen. Insgesamt stimmt die verringerte Expression dieser Aminosäuregene mit dem geringeren Proteingehalt der extrazellulären Matrix und dem weniger strukturierten Biofilm überein, der in der ΔpnpA-Mutante beobachtet wurde. Darüber hinaus besteht ein weiterer herunterregulierter Satz von Genen aus dem lmo1052-1055-Operon, das den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (pdh-Operon) kodiert, der für die Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA verantwortlich ist. Bei Streptococcus suis war die Proteinexpression von PDH im Biofilmzustand höher als im Planktonzustand71 und die Biofilmbildung war nach der PDH-Deletion signifikant verringert72.

Rifampicin-mRNA-Stabilitätstests und Northern-Blot-Analysen ergaben, dass PNPase am Abbau mindestens einer repräsentativen Teilmenge der hochregulierten Gene beteiligt ist, die in der transkriptomischen Analyse von Biofilmen identifiziert wurden. Im ΔpnpA-Mutantenstamm wurde im Vergleich zum Wildtyp-Stamm eine starke Stabilisierung der Transkripte von lmo0048/agrB, lmo0096/manL und lmo2125/malE beobachtet. Die hohen Mengen dieser Transkripte scheinen keine Folge einer erhöhten Transkription in Abwesenheit von PNPase zu sein, da eine transkriptionelle Fusion des Promotors von lmo0048 mit lacZ keine signifikanten Unterschiede in der β-Galactosidase-Aktivität zwischen dem Wildtyp- und dem ΔpnpA-Mutantenstamm zeigte. Diese Ergebnisse bestätigen, dass PNPase ein wichtiger posttranskriptioneller Regulator von Genen ist, die an der Biofilmbildung beteiligt sind, und belegen, dass die hochregulierten DEGs eine Folge der erhöhten Stabilität dieser Transkripte in Abwesenheit von PNPase sind. Die höheren Konzentrationen dieser mRNAs können die Translation der entsprechenden Proteine ​​verstärken und somit die Biofilmbildungswege beeinflussen.

Andererseits wurde beobachtet, dass die mRNA von lmo2006/alsS in der ΔpnpA-Mutante etwas schneller zerfiel. Dies legt nahe, dass PNPase möglicherweise indirekt die Stabilität von mRNAs aus herunterregulierten DEGs kontrolliert. Beispielsweise könnte PNPase die Menge eines Repressors dieser Transkripte (wie sRNAs) steuern73,74, oder PNPase könnte diese mRNAs vor dem Abbau durch andere Ribonukleasen schützen, ähnlich wie es für RNase II in E. coli beschrieben wurde75.

Darüber hinaus wurde festgestellt, dass PNPase die Expression von Genen beeinflusst, die für die Virulenz von Listerien wichtig sind. Bemerkenswerterweise zeigte die ΔpnpA-Mutante verringerte mRNA-Spiegel des Transkriptionsaktivators von Virulenzgenen, prfA, was auf niedrigere Spiegel des PrfA-Proteins hinweisen könnte. Da PrfA autoreguliert ist, ist es wahrscheinlich, dass niedrigere PrfA-Spiegel zu einer Verringerung der Expression von Virulenzfaktoren führen könnten76. Tatsächlich beobachteten wir, dass die Virulenzfaktoren inlA/Internalin A und hly/Listeriolysin O reduzierte mRNA-Werte in der ΔpnpA-Mutante aufwiesen, ohne größere Unterschiede in den mRNA-Halbwertszeiten zwischen der ΔpnpA-Mutante und dem Wildtyp-Stamm. Wichtig ist, dass wir in Abwesenheit von PNPase verringerte Internalin A-Spiegel fanden (Abb. 7). Die geringere Expression dieser Virulenzfaktoren könnte tatsächlich zur Erklärung der verringerten Invasion menschlicher Zelllinien durch die ΔpnpA-Mutante beitragen. Darüber hinaus trägt die verringerte Expression von PrfA wahrscheinlich zu den verringerten Biofilmmengen bei, die in den ΔpnpA-Mutanten beobachtet werden. Frühere Berichte hoben hervor, dass PrfA und Mitglieder des PrfA-Regulons als positive Determinanten der Biofilmproduktion in Listeria monocytogenes fungieren, da die Mutanten bei der Bildung von an der Oberfläche haftendem Biofilm fehlerhaft waren23,77,78. Es wurde vorgeschlagen23, dass diese Defekte auf Veränderungen der Zelloberfläche zurückzuführen sein könnten, die sich nachteilig auf die Biofilmentwicklung auswirken, da PrfA die Expression von Zelloberflächenfaktoren (wie Internalin A) und sekretierten Proteinen (wie Listeriolysin O) reguliert, deren mRNA-Spiegel ebenfalls verringert waren die ΔpnpA-Mutante. Schließlich haben wir auch getestet, ob PNPase an der Regulation von MogR, dem Transkriptionsrepressor von Flagellenmotilitätsgenen, beteiligt ist. Es wurde jedoch nicht festgestellt, dass PNPase die mogR-mRNA-Spiegel beeinflusst, was bedeutet, dass der im ΔpnpA-Mutantenstamm beobachtete Motilitätsdefekt unabhängig von MogR zu sein scheint. Daher ist die PNPase-abhängige Regulierung der bakteriellen Motilität komplexer als erwartet.

L. monocytogenes ist ein wichtiger lebensmittelbedingter Krankheitserreger und der Erreger der Listeriose, einer bakteriellen Infektion mit hoher Todesrate bei immungeschwächten Patienten9. Die Kontamination von Lebensmitteln aufgrund des Vorhandenseins von Biofilmen in Lebensmittelverarbeitungsumgebungen stellt weltweit eine wirtschaftliche Belastung dar79. Wir identifizierten das RNA-bindende Protein und die Ribonuklease PNPase als wichtigen Regulator der Pathogenität von L. monocytogenes, der nicht nur die Invasion der Wirtszellen, sondern auch die Biofilmbildung beeinflusst. Darüber hinaus haben wir PNPase-abhängige Regulierungswege entdeckt, die für die Entwicklung von Listeria-Biofilmen wichtig sind, und die Bedeutung der posttranskriptionellen Regulierung für die Anpassung pathogener Bakterien an den Biofilm-Lebensstil hervorgehoben. Andere RNA-bindende Proteine ​​wie Hfq und CsrA sind nachweislich an der Kontrolle der Biofilmbildung beteiligt, insbesondere durch ihre Wirkung auf Motilität, extrazelluläre Polysaccharidproduktion, c-di-GMP-Produktion und andere29,80,81, 82.

Zusammenfassend haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass PNPase ein posttranskriptioneller Regulator der Biofilmbildung von Listeria monocytogenes ist, wobei die Inaktivierung von PNPase zu einer verringerten Biofilmproduktion führt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass PNPase mehrere Stoffwechselwege beeinflusst, vom Kohlenhydrat- über den Aminosäurestoffwechsel bis zum Quorum-Sensing-System, und die Produktion extrazellulärer Matrix und damit die Bildung von Listeria-Biofilmen auf abiotischen Oberflächen beeinflusst. Diese Arbeit unterstreicht die Bedeutung von RNA-bindenden Proteinen bei der Anpassung an einen sessilen Lebensstil und erweitert unser Wissen über die Biofilmbildung bei grampositiven pathogenen Bakterien.

Alle Bakterienstämme und Plasmide sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Stämme sind der Stamm Listeria monocytogenes EGD-e (Wildtyp) und sein isogener Mutant ΔpnpA (der einen Nullmutanten von PNPase/Lmo1331 trägt). Die PNPase-Komplementierung wurde durch Klonierung eines PCR-Fragments, das die Gesamtsequenz des pnpA-ORF mit 343 bps stromaufwärts und 162 bps stromabwärts (Primer pPL2-pnpA-BamHI und pPL2-pnpA-SalI) enthält, in den pPL2-Vektor nach Integration in die ΔpnpA-Mutante erhalten Stamm, was zum komplementären Stamm ΔpnpA::pnpA35 führte. Die Stämme wurden routinemäßig in Brain Heart Infusion (BHI)-Medium (BD Difco™) gezüchtet. Für das ΔpnpA::pnpA-Wachstum wurde Chloramphenicol bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml hinzugefügt. Kanamycin wurde in einer Menge von 50 μg/ml zugegeben, wenn entweder E. coli- oder L. monocytogenes-Stämme pTCV-Derivate trugen.

Es wurden zwei menschliche Zelllinien verwendet: HeLa (ATCC® CCL-2™) und HepG2 (ATCC® HB-8065™). Die Zellen wurden routinemäßig bis zu einer Konfluenz von 80–90 % in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Biowest) mit hohem Glucose- und L-Glutamingehalt, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Biowest), gezüchtet. HeLa (1 × 105 Zellen/Vertiefung) und HepG2 (1 × 105 Zellen/Vertiefung) wurden in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen ausgesät und vor der Infektion 24 Stunden lang bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert (48 Stunden für HepG2). ). Das Protokoll des Internalisierungstests wurde von Lit. angepasst. 40. Kurz gesagt, Bakteriensuspensionen wurden auf die angegebene Infektionsmultiplizität (MOI) verdünnt, zu den Zellen gegeben und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Danach wurde DMEM mit Gentamicin (40 μg/ml) hinzugefügt und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach dem Waschen wurden menschliche Zellen mit 0,1 % (v/v) Triton

Die Bilder wurden mit einem Leica DM 6000B-Aufrechtmikroskop aufgenommen, das mit einer Andor iXon 885 EMCCD-Kamera ausgestattet und mit der MetaMorph V5.8-Software (Molecular Devices LLC) gesteuert wurde, unter Verwendung des 100×1,4 NA-Ölimmersionsobjektivs plus einem 1,6×-Optivar Phasenkontrastoptik. Die Bildverarbeitung wurde mit Fiji-Software durchgeführt. Unbeschnittene Bilder finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

Bilder aus den Makrokolonien wurden mit einem Zeiss Axio Zoom.V16-Stereomikroskop aufgenommen, das mit einer Zeiss Axiocam 503 Mono-CCD-Kamera ausgestattet und mit der Software Zeiss Zen 2.1 (Blue Edition) (Zeiss) gesteuert wurde, unter Verwendung des 1 × 0,25 NA-Objektivs und des Bright Feldoptik. Die Bildverarbeitung wurde mit Fiji-Software durchgeführt. Zur Bestimmung der Schwimmmotilität wurde eine Bakteriensuspension mit OD600 ∼ 0,7 auf BHI-Weichagarplatten (0,3 % (w/v) Agar) inokuliert. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 25 °C inkubiert und mit der Epi-White-Funktion auf Gel Doc XR (Bio-Rad) fotografiert (ergänzende Abbildung 2).

Über Nacht gewachsene Kulturen wurden einmal in frischem BHI gewaschen, 1:100 verdünnt und 500 µL wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 37 °C unter statischen Bedingungen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Biofilme mit Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1× w/o Ca2+/Mg2+ (DPBS) (Biowest) gewaschen und bei 37 °C getrocknet, gefolgt von der Zugabe von 0,1 % (w/v) Kristallviolettlösung. Die Platte wurde gewaschen und nach vollständiger Trocknung mit dem Image Scanner III (GE) gescannt. Um die Biomasse jedes Biofilms zu quantifizieren, wurde 33 % (v/v) Essigsäure zugegeben, um den CV zu solubilisieren, und A595 wurde mit einem Spektrophotometer (BioPhotometer plus, Eppendorf) gemessen.

In jede Vertiefung der Platte mit 24 Vertiefungen wurden sterile runde Deckgläser gelegt und die Bakteriensuspensionen wurden wie im „Biofilmbildungstest“ beschrieben hergestellt. Nach einer 48-stündigen Inkubation bei 37 °C wurden die Biofilme mit DPBS gewaschen. Anschließend wurden sie mit der Fixierungslösung (2,5 % (v/v) Glutaraldehyd, 1 % Formaldehyd und 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,4) fixiert und mit 0,1 M Cacodylatpuffer gewaschen. Die Proben wurden nach und nach unter Verwendung zunehmender Ethanolkonzentrationen (50 %, 70 %, 90 %, 100 %) dehydriert und schließlich 2 Stunden lang mit Tert-Butylalkohol versetzt, gefolgt von einem Einfrieren bei –20 °C bis zur späteren Verwendung. Die Proben wurden unter Vakuumbedingungen lyophilisiert und bis zur Durchführung der SEM-Analysen bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Proben wurden mit Gold (ca. 6 nm Dicke) unter Verwendung eines Elektronensputters (Cressington 108) 15 s lang bei 10 mA beschichtet und in einem Hitachi SU8010 Rasterelektronenmikroskop bei 1,5 kV für einen WD von 6 mm abgebildet.

Biofilme wurden 48 Stunden lang auf sterilen runden Glasdeckgläsern gebildet und dann mit DPBS gewaschen. Um die Biofilmdicke zu beobachten, wurden Biofilme mit 3 µM SYTO™ 9-Fluoreszenzfarbstoff (Thermo Fisher Scientific) angefärbt und Bilder wurden mit CLSM unter Verwendung der 488-nm-Ar+-Laserlinie (Emission gesammelt bei 500–590 nm) und Scannen von Z-Stapeln aufgenommen bei einer Scanschrittweite von 1,5 µm. Um die extrazelluläre DNA und Bakterienzellen der Biofilmmatrix zu beobachten, wurde zuerst SYTO™ 9 (Thermo Fisher Scientific) mit 3 µM in DPBS hinzugefügt, gefolgt von TO-PRO™-3-Iodid (Thermo Fisher Scientific) Fluoreszenzfarbstoff mit 4 µM in DPBS45. Die Bilder wurden mit der 488-nm-Ar+-Laserlinie (Emission bei 500–590 nm gesammelt) bzw. der 633-nm-He-Ne-Laserlinie (Emission bei 645–795 nm gesammelt) aufgenommen. Zur Proteinfärbung wurde FilmTracer™ SYPRO® Ruby Biofilm Matrix (Thermo Fisher Scientific) verwendet47. Die Bilder wurden mit der 476-nm-Ar+-Laserlinie aufgenommen (Emission bei 600–740 nm gesammelt). Der Rutheniumrot-Phenanthrolin (RR-OP)-Komplex wurde verwendet, um Polysaccharide in der Biofilmstruktur anzufärben. Die Synthese des RR-OP-Komplexes folgte einem modifizierten Protokoll von Bertolesi et al.50. Kurz gesagt wurden 20 mg Rutheniumrot (RR) in 10 ml destilliertem Wasser gelöst und dann 10 mg 1,10-Phenanthrolin (OP) zur Lösung gegeben. Anschließend wurde die Mischung 50 Minuten lang auf 100 °C erhitzt. Der Komplex wurde als dunkelgrüne Lösung erhalten, die weiter zum Färben von Biofilmen bei 2 mg/ml verwendet wurde. Die Bilder wurden mit der 458-nm-Ar+-Laserlinie aufgenommen (Emission bei 490–625 nm gesammelt). In allen Fällen wurde ein inverses Mikroskop Leica TCS SP5 mit einem apochromatischen 63-fachen Wasserobjektiv (1,2 numerische Apertur) verwendet. Die Bilder wurden mit 512 × 512 Pixeln bei einer Scanrate von 100 Hz erfasst, mit Ausnahme der Z-Stack-Messungen, die bei 200 Hz durchgeführt wurden. Dreidimensionale Bilder der Biofilme wurden mit der Imaris-Software (Bitplane) erstellt. Biofilmbiomasse, maximale Dicke und Rauheitskoeffizient wurden aus den Z-Stapeln mit der COMSTAT-Software83 quantifiziert.

Für die Extraktion und Quantifizierung von Biofilm-Matrixkomponenten wurde eine Adaption der zuvor von Combrouse et al.84 beschriebenen Quantifizierungsmethode angewendet. Nach dem Sammeln der Biofilme wurde jede Suspension auf Eis mit einem Sondenbeschaller (UP 200 s, Dr. Hielscher GmbH) beschallt. Nach der Ultraschallbehandlung wurde die OD600 zur weiteren Normalisierung gemessen und die Suspensionen wurden bei 3100 × g zentrifugiert, um die Überstände zur Quantifizierung zu sammeln. Die Konzentration der Polysaccharide in der Biofilmmatrix wurde mit der Phenol-Schwefelsäure-Methode bestimmt, wobei Glucose als Standard verwendet wurde85,86. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bradford-Reagenz87 (Bio-Rad) quantifiziert, wobei Rinderserumalbumin als Standard diente. Die extrazelluläre DNA der Biofilmmatrix wurde durch die Phenol-Chloroform-Extraktionsmethode88 gewonnen und die Konzentration wurde mit NanoDropOnec (Thermo Fisher Scientific) bestimmt.

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) von Gentamicin und Erythromycin in Wildtyp- und ΔpnpA-Mutantenstämmen wurden mithilfe einer Adaption der zweifachen Bouillon-Mikroverdünnungsmethode in Mikrotiterplatten mit BHI bei 37 °C bestimmt. Die MHK wurde durch die niedrigste Konzentration an antibiotikahemmendem Bakterienwachstum bestimmt. Für die Eradikationstests wurden die Antibiotikalösungen (in BHI) nach dem Waschen zu 48 Stunden alten Biofilmen gegeben und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde jede Vertiefung mit sterilem DPBS gewaschen und anschließend 5 Minuten lang in einem Ultraschallbad beschallt. Der Biofilm wurde entfernt und gewonnen und Reihenverdünnungen wurden in sterilem DPBS durchgeführt und auf BHI-Agarplatten ausplattiert. KBE/ml wurde nach Inkubation über Nacht bei 37 °C bestimmt.

Biofilme wurden mit DPBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Puffer A (10 % (v/v) Glucose, 12,5 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA in H2O) zu jeder Vertiefung und der Biofilm wurde gesammelt. Die Zelllyse wurde mit FastPrep®-24 (MP Bio) durchgeführt, gefolgt von der Phenol-Chloroform-Methode und der Fällung mit Ethanol35. Zur Entfernung genomischer DNA wurde Turbo DNase (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Die Qualität und Integrität der RNA wurde durch Agarosegelelektrophorese und auf dem Qubit™ 4 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) analysiert.

Gesamt-RNA-Proben von zwei biologischen Replikaten von Wildtyp- und ΔpnpA-Mutantenstämmen wurden bei STAB VIDA (Portugal) mit einer Illumina HiSeq 4000-Plattform (Paired-End, 150 bp Leselänge, 20 M Lesevorgänge) sequenziert. Der Aufbau der cDNA-Bibliothek wurde mit dem Kapa RNA Hyper Prep Library-Vorbereitungskit mit QIA FastSelect -5S/16 S/23 S rRNA-Depletion durchgeführt. Die RNA-seq-Daten wurden nach dem in Pobre und Arraiano89 beschriebenen Arbeitsablauf analysiert. Die Lesevorgänge wurden mit dem Bowtie2-Programm gegen das Genom von L. monocytogenes (NC_003210.1, heruntergeladen aus der NCBI-Genomdatenbank) kartiert. Die Visualisierung der Daten erfolgte mit Artemis Genome Browser. Die Differenzialausdrucksanalyse wurde mit dem R-Paket edgeR durchgeführt. Wir betrachteten alle Transkripte mit einer False Discovery Rate (FDR)-Korrektur des P-Werts von weniger als 0,1 als signifikant und filterten unsere Ergebnisse weiter unter Verwendung der Ausdruckswerte (log2 CPM) über 3 und einer fachen Änderung zwischen zwei Proben über 2. Aufgrund der geringen Anzahl biologischer Replikate für jeden Stamm haben wir uns für die Verwendung einer moderaten FDR-Korrektur des P-Werts von weniger als 0,1 anstelle eines strengeren Werts von 0,05 entschieden, um eine Unterschätzung der DEGs zu vermeiden. Die funktionale Annotation wurde mit dem DAVID-Tool zur funktionalen Annotation durchgeführt.

cDNA wurde aus 1 µg gereinigter RNA unter Verwendung des SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit (Bioline) synthetisiert. Die an eine quantitative PCR (qPCR) gekoppelte reverse Transkription wurde mit einem Real Time Thermal Cycler qTower-System (Analytik Jena) und unter Verwendung des SensiFAST SYBR No-ROX-Kits (Bioline) gemäß den Anweisungen des Lieferanten durchgeführt. Primer für qPCR sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Die relative Quantifizierung der Genexpression wurde mit der 2-ΔΔCt-Methode und unter Verwendung von gyrA (lmo0007) als Housekeeping-Referenzgen berechnet.

Um die RNA-Stabilität zu bestimmen, wurden Bakterienkulturen in BHI-Medium bei 37 °C unter Rühren bis zur stationären Phase (OD600 ∼ 3) gezüchtet. Die Transkription wurde durch Zugabe von Rifampicin bis zu einer Endkonzentration von 500 µg/ml blockiert. Der Zeitpunkt Null wurde unmittelbar vor der Zugabe von Rifampicin erfasst. Kulturproben wurden zu definierten Zeitpunkten gesammelt und mit 0,2 Volumina RNA-Stopppuffer (1:20 saure Phenol:Ethanol-Lösung) gemischt, gefolgt von Zentrifugation und Schockgefrieren. Nach dem Resuspendieren der Pellets in Puffer A wurde die Zelllyse mit FastPrep®-24 (MP Bio) durchgeführt, gefolgt von einer Phenol-Chloroform-Extraktion und Fällung mit Ethanol. Für die Northern-Blot-Analyse wurden 10–40 µg Gesamt-RNA in 1 % Agarose-Formaldehyd-denaturierendem Gel in MOPS-Puffer fraktioniert. RNAs wurden auf eine Hybond-N+-Membran (Cytiva) übertragen und durch UV-Bestrahlung unter Verwendung eines UVC 500-Geräts (Amersham Biosciences) UV-vernetzt. DNA-Oligonukleotidsonden wurden am 5'-Ende mit [γ-32P]-ATP (PerkinElmer) unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (Thermo Fisher Scientific) markiert. Radioaktiv markierte Sonden wurden auf G25-Microspin-Säulen (Cytiva) gereinigt. Die Membranen wurden in PerfectHyb Plus Hybridisierungspuffer (Sigma-Aldrich) bei 42 °C über Nacht hybridisiert und mit dem FUJI TLA-5100-Scanner (Fujifilm) analysiert. Die Halbwertszeiten der RNA wurden durch lineare Regression unter Verwendung des Logarithmus des Prozentsatzes der verbleibenden RNA gegenüber der Zeit bestimmt, wobei die RNA-Menge bei 0 Minuten als 100 % betrachtet wurde. Unverarbeitete Bilder der Northern Blots finden Sie in den ergänzenden Abbildungen. 3 und 4. Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotidsonden sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Um die Transkriptionsfusionsvektoren Plmo0048-lacZ und Plmo2006-lacZ zu konstruieren, wurde die Promotorregion jedes Gens mittels PCR mit den entsprechenden Primerpaaren amplifiziert (Ergänzungstabelle 3). Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und BamHI (Thermo Fisher Scientific) verdaut und in die entsprechende Stelle des pTCV-basierten Expressionsvektors mit niedriger Kopienzahl eingefügt, der promotorloses E. coli lacZ (pTCV-lacZ)54 trägt. Die resultierenden Plasmidkonstrukte wurden in E. coli S17-1 transformiert, das zur Konjugation90 mit L. monocytogenes EGD-e WT und der isogenen ΔpnpA-Mutante verwendet wurde.

Die Promotoraktivität wurde durch Messung der β-Galactosidase-Aktivität unter Verwendung des pTCV-Plasmids54 analysiert. Die Zellen wurden in BHI-Medium bei 37 °C unter Rühren bis zur stationären Phase (OD600 ∼ 3) gezüchtet. Die gesammelten Proben (1 ml) wurden zentrifugiert und die Pellets schockgefroren. Die Pellets wurden in 1 ml Z-Puffer (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 50 mM β-Mercaptoethanol, pH 7,0) resuspendiert und die OD600 gemessen. Die Zellen wurden mit 0,5 % Toluol und 4,5 % Ethanol 5 Minuten lang bei 30 °C in einem Wasserbad permeabilisiert. Um die β-Galactosidase-Aktivität zu bestimmen, wurden jeder Probe 200 µl Z-Puffer mit 4 mg/ml o-Nitrophenyl-β-d-galactopyranosid (ONPG, Sigma-Aldrich) zugesetzt und anschließend bei 30 °C in Wasser inkubiert Bad. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 500 µL 1 M NaCO3 gestoppt und die Zeit aufgezeichnet. Die Absorption bei 420 nm wurde nach 5-minütiger Zentrifugation bei 21.000 × g gemessen. Die β-Galactosidase-Aktivität (Miller-Einheiten) wurde als (1000 × A420)/(T × V × OD600) berechnet. T, Reaktionszeit (in Minuten); V, Bakterienvolumen (in ml).

Zur vollständigen Proteinextraktion wurden Bakterienkulturen in BHI-Medium bei 37 °C unter Rühren bis zur stationären Phase (OD600 ∼ 3) gezüchtet und anschließend zentrifugiert. Die Zelllyse wurde mit FastPrep®-24 (MP Bio) durchgeführt und der Proteinextrakt wurde aus dem Überstand gewonnen. Die Proteinquantifizierung wurde wie oben unter Verwendung von Bradfords Reagenz durchgeführt.

Proteinproben wurden in ein Bolt™ 4–12 % Bis-Tris Plus Gel (Invitrogen™) mit MOPS 1X-Puffer, ergänzt mit Bolt™ Antioxidant (0,25 %), geladen und ein Mini-Gel-Tanksystem (Invitrogen™) verwendet. Die Übertragung auf Nitrozellulosemembranen wurde mit dem Mini-Blot-Modul (Invitrogen™) durchgeführt. Zum Proteinnachweis wurden die Membranen 1 Stunde lang mit Blockierungslösung (TBS + 0,1 % Tween-20 (TBS-T) + 5 % fettfreies Milchpulver) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit den folgenden Primärantikörpern inkubiert: Kaninchen α-InlA 1:5000 (Cusabio) oder Kaninchen-α-EF-Tu 1:40000 (Abcam) in TBS-T. Der Sekundärantikörper Ziegen-α-Kaninchen-IgG-HRP 1:20.000 (Sigma) wurde 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Der Nachweis erfolgte durch Chemilumineszenz unter Verwendung des Western Lightning® Plus-ECL Enhanced Chemilumineszenzsubstrats (PerkinElmer) im iBright™ CL1500 Imaging System (ergänzende Abbildung 5). Die Bilder wurden mit der Fiji-Software quantifiziert.

Experimentelle Daten wurden mit GraphPad Prism Version 8.0.1 (GraphPad Software) analysiert. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz der meisten Experimente wurde der Student-t-Test verwendet. Ein Vergleich zwischen Antibiotika-Behandlung und Kontrolle wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) oder als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Ein AP-Wert von <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Veröffentlichung besprochenen Daten wurden im Gene Expression Omnibus des NCBI hinterlegt und sind über die GEO-Serien-Zugangsnummer GSE210097 zugänglich.

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Diese Arbeit wurde von der FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP, unterstützt durch: MOSTMICRO-ITQB R&D Unit (UIDB/04612/2020, UIDP/04612/2020); LS4FUTURE Associated Laboratory (LA/P/0087/2020); Grant PTDC/BIA-MIC/32525/2017 an JMA; Doktorandenstipendium an APQ (PD/BD/135487/2018); FCT-Verträge gemäß DL57/2016 an SNP (SFRH/BPD/92409/2013) und an VP (SFRH/BPD/87188/2012).

António-Xavier-Institut für chemische und biologische Technologie, Neue Universität Lissabon (ITQB NOVA), Avenida da República, 2780-901, Oeiras, Portugal

Ana Patrícia Quendera, Vânia Pobre, Cecília Maria Arraiano und José Marques Andrade

Institut für Bioingenieurwesen und Biowissenschaften (IBB) und assoziiertes Labor – Institut für Gesundheit und Bioökonomie (i4HB), Instituto Superior Técnico, Universität Lissabon, Av. Rovisco Pais, 1049-001, Lissabon, Portugal

Sandra Nunes Pinto & Basco DB Boniface

Labor für Bild-, Nanomorphologie- und Röntgenspektroskopie (Linx) des Militärlabors für biologische und chemische Verteidigung (UMLDBQ), Militäruniversitätsinstitut, Forschungs-, Innovations- und Entwicklungszentrum der Militärakademie, Av. Dr. Alfredo Bensaúde, 1100-471 , Lissabon, Portugal

Wilson Antunes

Abteilung für Bioingenieurwesen, Instituto Superior Técnico, Universität Lissabon, Av. Rovisco Pais, 1049-001, Lissabon, Portugal

Baskischer DB Bonifatius

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JMA konzipierte das Projekt; APQ, SNP und JMA haben die Studie entworfen; CMA und JMA überwachten gemeinsam die Arbeit von APQ; APQ, SNP, WA, VDBB und JMA führten Experimente durch; APQ, SNP, VP und JMA analysierten die Daten; JMA führte die Projektverwaltung und die Finanzierungseinwerbung durch; APQ und JMA haben den Artikel geschrieben. Alle Autoren trugen zur Diskussion, Überprüfung und Bearbeitung der endgültigen Fassung des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit José Marques Andrade.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Quendera, AP, Pinto, SN, Pobre, V. et al. Die Ribonuklease PNPase ist ein wichtiger Regulator der Biofilmbildung in Listeria monocytogenes und beeinflusst die Invasion von Wirtszellen. npj Biofilms Microbiomes 9, 34 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00397-1

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Eingegangen: 25. Oktober 2022

Angenommen: 18. Mai 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00397-1

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